La Rete di Imprese VIPERMED NET si è costituita nel 2022 con l’obiettivo primario di realizzare il progetto VIPERMED “sVIluppo di Processo e di sistema diagnostico per analisi mutazionali di patologie Ereditarie Retiniche e nefrologiche basato su MEtoDiche avanzate di sequenziamento genico e per monitoraggio digitale dei pazienti”, intervento realizzato avvalendosi del Finanziamento Piano Sviluppo e Coesione Veneto – Sezione Speciale”.
Le società partecipanti alla rete sono:
Il progetto si propone di sviluppare saggi diagnostici genetici basati su metodiche NGS per la diagnosi di malattie ereditarie quali la malattia del Rene Policistico e le Retinopatie, eseguibili utilizzando kit di reagenti e software di analisi da commercializzare come dispositivi IVD (In Vitro Diagnostics), ossia dispositivi medico-diagnostici in vitro conformi al Regolamento Europeo per i dispositivi medici diagnostici in vitro (Regolamento Europeo n. 2017/746, abbrev. IVDR) e dotati quindi della corrispondente marcatura CE (marcatura CE IVD). Oltre allo sviluppo di metodiche NGS applicabili in generale alla diagnosi di malattie ereditare, tali metodiche verranno applicate a due casi concreti di particolare interesse, verranno infatti sviluppati in particolare: 1. un dispositivo IVD per la diagnosi di rene policistico autosomico dominante (ADPKD, Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease), che rappresenta una delle maggiori cause genetiche di morbidità e mortalità nella popolazione adulta 2. un dispositivo IVD per la determinazione di mutazioni causative di distrofie ereditarie della retina (IRDs, Inherited Retina Distrophies), un gruppo di patologie oculari geneticamente determinate caratterizzate da una progressiva perdita della visione nel tempo, per alcune delle quali, quelle causate da mutazioni del geneRPE65, è disponibile una terapia genica innovativa. Il progetto si propone infine di sviluppare un dispositivo medico digitale per la gestione della retinopatia, con funzioni: 1. di misurazione della funzione visiva attraverso la esecuzione di test specifici quali la griglia di Amsler per consentire il monitoraggio della patologia e fornire al medico oculista le informazioni necessarie alla valutazione clinica 2. di trattamento della malattia stessa, attraverso l’erogazione ai pazienti e ai loro caregiver di contenuti educativi utili sia a migliorare la propria qualità di vita nonostante la malattia, che a sostenerli nel loro percorso di aderenza terapeutica.
Descrizione
Negli ultimi anni le metodiche NGS (Next Generation Sequencing), sviluppate a partire dall’inizio degli anni 2000 e successivamente impiegate sempre più estesamente in ricerca, permettendo la determinazione delle sequenze costituenti il DNA genomico, il trascrittoma (RNA) e l’epigenoma con costi via via decrescenti e produttività crescenti, hanno fatto il loro ingresso anche in clinica, sostituendo progressivamente molte metodiche già in uso e permettendo nuove applicazioni della diagnostica molecolare grazie all’ampiezza delle informazioni che si ottengono da queste analisi, con un andamento in forte crescita che continua tuttora.
Il progetto si propone di sviluppare saggi diagnostici genetici basati su metodiche NGS per la diagnosi di malattie ereditarie, eseguibili utilizzando kit di reagenti e software di analisi da commercializzare come dispositivi IVD (In Vitro Diagnostics), ossia dispositivi medico-diagnostici in vitro conformi al Regolamento Europeo per i dispositivi medici diagnostici in vitro (Regolamento Europeo n. 2017/746, abbrev. IVDR) e dotati quindi della corrispondente marcatura CE (marcatura CE IVD).
Oltre allo sviluppo di metodiche NGS applicabili in generale alla diagnosi di malattie ereditare, tali metodiche verranno applicate a due casi concreti di particolare interesse, verranno infatti sviluppati in particolare
- un dispositivo IVD per la diagnosi di rene policistico autosomico dominante (ADPKD, Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease), che rappresenta una delle maggiori cause genetiche di morbidità e mortalità nella popolazione adulta
- un dispositivo IVD per la determinazione di mutazioni causative di distrofie ereditarie della retina (IRDs, Inherited Retina Distrophies), un gruppo di patologie oculari geneticamente determinate caratterizzate da una progressiva perdita della visione nel tempo, per alcune delle quali, quelle causate da mutazioni del gene RPE65, è disponibile una terapia genica innovativa.
Il progetto si propone anche di automatizzare parte dei processi di produzione di dispositivi IVD basati su metodiche NGS, che presentano complessità superiori rispetto ai processi produttivi di dispositivi IVD basati su altre metodiche in biologia molecolare più consolidate.
Il sequenziamento NGS richiede, dopo la fase preanalitica di estrazione e purificazione dell’acido nucleico (DNA o del RNA) comune alle altre metodiche in biologia molecolare, delle fasi di preparazione del campione al sequenziamento, la cosiddetta Library Preparation.
Le Libraries sono frammenti corti di acidi nucleico (dell’ordine delle centinaia di basi, i costituenti elementari dei filamenti di acido nucleico) opportunamente preparati per consentire il sequenziamento.
Per permettere il sequenziamento di regioni ristrette (targeted) senza dover sequenziare l’intero genoma, si possono utilizzare due approcci per selezionare solo frammenti che ricadono nelle regioni di interesse
- a cattura, in cui le regioni di interesse vengono catturate per ibridazione (appaiamento) a sequenze di acido nucleico (sonde) complementari a quelle che devono essere catturate; le sonde sono vincolate su particelle magnetiche che possono essere catturate con l’uso di magneti, trascinando con sé selettivamente i frammenti ad esse appaiati
- ad ampliconi, in cui le regioni di interesse vengono replicate selettivamente in grande quantità attraverso reazioni di polimerizzazione tramite reazioni PCR (Polymerase Chain Reaction) che partono da sequenze di innesco (primer) che si appaiano alle estremità delle regioni da selezionare (processo di amplificazione dell’acido nucleico).
Le diverse sequenze di sonde o di primer vengono acquistate come materie prime da aziende che le sintetizzano, e vengono miscelate in fase di produzione del kit di reagenti per il sequenziamento, generando i pool di sonde o primer che verranno usati dall’utilizzatore del kit per preparare i campioni al sequenziamento.
Pool di sonde e primer vengono usati anche in altre metodiche in biologia molecolare, ma nelle metodiche NGS le diverse sequenze possono essere dell’ordine di diverse centinaia, mentre nelle altre metodiche in biologia molecolare sono tipicamente dell’ordine di qualche unità.
Il controllo di qualità di sonde e primer avviene eseguendo delle reazioni di cattura o di amplificazione di prova, ed è piuttosto laborioso e soggetto ad errori e a problemi di contaminazione. Scalare tali procedure da poche unità di sequenze diverse a diverse centinaia di sequenze diverse pone seri problemi di sostenibilità del processo produttivo, per la lunghezza delle procedure e per la elevata probabilità di errori che possono determinare la necessità di scartare il lotto di produzione.
Verranno pertanto studiati processi automatici per l’effettuazione dei controlli di qualità di sonde e primer, a partire dall’acquisizione in automatico, nei sistemi informativi a supporto dei reparti di produzione, dei dati di sequenza che accompagnano le sequenze, allo studio di processi di allestimento automatizzato delle reazioni per il controllo di qualità, in condizioni di abbattimento della contaminazione.
Nell’ottica di una offerta integrata al fianco del medico specialista lungo tutto il percorso di gestione del paziente, il progetto si propone infine di sviluppare un dispositivo medico digitale per la gestione della retinopatia. L’applicazione digitale avrà funzioni:
- di misurazione della funzione visiva attraverso la esecuzione di test specifici quali la griglia di Amsler per consentire il monitoraggio della patologia e fornire al medico oculista le informazioni necessarie alla valutazione clinica
- di trattamento della malattia stessa, attraverso l’erogazione ai pazienti e ai loro caregiver di contenuti educativi utili sia a migliorare la propria qualità di vita nonostante la malattia, che a sostenerli nel loro percorso di aderenza terapeutica.
In aggiunta a tale attività a finalità clinica, il dispositivo medico digitale fornirà inoltre al paziente una serie di funzioni per la gestione di servizi assistenziali, quali l’accesso alla prenotazione a servizi medici di oculistica e di supporti specifici per il caregiver.
Il dispositivo medico digitale sarà idoneo ad essere sottoposto a valutazione di efficacia clinica attraverso sperimentazione clinica e ad essere successivamente certificato quale dispositivo medico. Sarà inoltre integrabile nelle piattaforme di telemedicina per agevolare il dialogo e la comunicazione da remoto tra paziente e medico.
In commercio sono presenti dei kit per la determinazione dello stato di avanzamento della patologia come il Verana Vision test che prevede l’analisi della capacità visiva da remoto, in questo modo il paziente può fare l’analisi da casa e fornire i risultati al proprio medico senza la necessità di recarsi in ospedale. Questo kit andrà oltre, non solo consentirà la stadiazione della malattia e il consulto con il medico ma fornirà ai pazienti delle indicazioni per il trattamento e la convivenza con questa patologia. Il dispositivo fungerà inoltre da collegamento tra il paziente e l’azienda sanitaria locale facilitando la prenotazione delle visite specialistiche e l’accesso ai servizi assistenziali.
Il progetto si inserisce nell’ambito di specializzazione Smart Agrifood percorrendo la traiettoria 7: MIGLIORARE LA SALUTE E IL BENESSERE DEI CONSUMATORI, ATTRAVERSO CIBI IN GRADO DI APPORTARE ELEMENTI UTILI E FUNZIONALI AL MIGLIORAMENTO DELLO STATO DI SALUTE. In questa traiettoria rientra infatti (DGR n. 216 del 28 febbraio 2017) l’“impiego di biomarcatori per la medicina personalizzata”, finalità perseguita nel progetto in quanto l’individuazione delle mutazioni causanti le malattie genetiche può permettere il trattamento con terapie mirate, quali per esempio la terapia genica per le distrofie ereditarie della retina causate da mutazioni di RPE65. In questa traiettoria rientra anche lo “sviluppo e introduzione di metodiche innovative basate sul DNA” di cui fanno parte le metodiche NGS di sequenziamento del genoma utilizzate nel progetto qui presentato. Infine, in questa traiettoria rientrano le “innovazioni in ambito nutraceutico, utilizzo di materie prime combinate per prodotti attenti all’alimentazione umana (es. contrastare problemi di intolleranza, allergia o causa di malattie)” a cui le metodiche utilizzate nel progetto contribuiscono attraverso il loro impiego nella diagnosi di condizioni genetiche che determinano o predispongono a intolleranze alimentari, quali per esempio la celiachia, l’intolleranza al lattosio e il favismo.
Per quanto riguarda le tecnologie abilitanti questo progetto rientra nel campo delle biotecnologie industriali in quanto tratta dello sviluppo a livello industriale di un kit basato su tecniche biotecnologiche ossia l’NGS. Un’altra tecnologia abilitante che è coinvolta in questo progetto è la fotonica essendo alla base della rilevazione dei nucleotidi marcati durante il processo di sequenziamento. L’NGS infatti prevede la ricostruzione della sequenza genica mediante un approccio denominato “Sequencing by Synthesis” dove il segnale di fluorescenza emesso dal singolo nucleotide viene captato dallo strumento consentendo la ricostruzione della sequenza genica.
Il progetto rientra nel driver d’innovazione “Active ageing” in quanto la diagnosi genetica precoce è uno degli elementi chiave per ripensare il modello di gestione delle malattie rare di origine genetica in età adulta [Osservatorio Malattie Rare, https://www.osservatoriomalattierare.it/malattie-rare/amiloidosi-cardiaca/16249-malattie-rare-nell-adulto-tra-le-priorita-una-diagnosi-precoce-e-maggiore-conoscenza]. Si tratta di patologie eterogenee, come la malattia di Huntington, la malattia di Charcot-Marie-Tooth, la amiloidosi cardiaca ereditaria, la cui prevalenza nell’adulto è destinata ad aumentare, con problematiche assistenziali diverse a seconda dell’età che necessitano di essere affrontate globalmente e che richiedono una particolare e specifica tutela, per le difficoltà diagnostiche, la gravità clinica, il decorso cronico, gli esiti invalidanti e l’onerosità del trattamento. Senza dimenticare il ruolo chiave del caregiver, chi si prende cura dei malati rari in famiglia, con impatti sulla produttività e sui costi indiretti legati a queste malattie.
